Topmusicanswers
Penyelesaian Masalah Pengukuhan PCR dan RT-PCR
| Masalah | Sebab yang mungkin |
|---|---|
| Tiada jalur pada gel | Masa peluasan terlalu pendek |
| Pengitar termal tidak berada pada suhu yang betul | |
| Jalur tambahan yang tidak khusus pada gel | Primer di hibrid ke laman sekunder pada templat |
| Pencemaran DNA diperkenalkan pada primer atau buffer |
- Apa yang menyebabkan kegagalan PCR?
- Bagaimana anda menyelesaikan masalah PCR?
- Apa yang akan anda lakukan sekiranya penguatan PCR sampel gagal?
- Apa yang berlaku apabila anda menambahkan terlalu banyak primer ke PCR?
Apa yang menyebabkan kegagalan PCR?
Biasanya perkara pertama yang dilakukan oleh penyelidik adalah menyalahkan enzim atau reagen yang salah apabila percubaan gagal tetapi dengan PCR ini sebenarnya cenderung menjadi penyebab kegagalan. Masalah dalaman yang lebih kerap seperti reka bentuk primer, parameter termocycler, atau pengikatan yang tidak spesifik untuk urutan templat lain adalah penyebabnya.
Bagaimana anda menyelesaikan masalah PCR?
Periksa keupayaan panjang amplifikasi polimerase DNA yang dipilih. Gunakan DNA polimerase yang direka khas untuk PCR panjang. Pilih DNA polimerase dengan proses yang tinggi, yang dapat meningkatkan sasaran panjang dalam masa yang lebih singkat. Kurangkan suhu penyepuhlindapan dan pemanjangan untuk membantu pengikatan primer dan termostabiliti enzim.
Apa yang akan anda lakukan sekiranya penguatan PCR sampel gagal?
Sekiranya reaksi penguat gagal dan anda mengesyaki templat DNA tercemar dengan perencat, tambahkan persediaan DNA yang disyaki ke reaksi kawalan dengan templat DNA dan pasangan primer yang telah berkembang baik pada masa lalu .
Apa yang berlaku apabila anda menambahkan terlalu banyak primer ke PCR?
Penggunaan primer dengan kepekatan yang lebih tinggi boleh memberi kesan berikut: Sekiranya primer mampu membentuk dimer, peningkatan kepekatannya hanya menghasilkan pencetus primer dan tidak meningkatkan penguatan produk PCR yang diinginkan.
